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NGS科研用建庫試劑盒
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K02421T-S/L RNA Seq Library Preparation Kit for Transcriptome Discovery–Illumina Compatible

流程介紹
科維思RNA轉錄組測序文庫構建試劑盒主要特點有:單管反應,較少的實驗操作,一天即可完成整個流程。測序接頭直接連接在mRNA或合成的第一條cDNA上,這使得我們能對轉錄組進行方向性測序。這種方法所提供的方向性信息對RNA從頭測序(de novo)來說有極大的幫助,同時還有助于識別各種調控事件中相互關聯的轉錄RNA信息。通過省略一些步驟,降低了樣品起始量,該試劑盒可實現低至1ng mRNA樣品的文庫構建,還可以應用于FFPE樣品的建庫。

流程圖


產品優勢
• 更好的方向性信息——五種方向性RNA建庫產品比較,本產品的方向性更好
• 更好的科學發現——對全轉錄組進行方向性測序
• 更簡單的流程——省略了第二條cDNA鏈合成和接頭連接步驟
• 更小的樣本初始量——低至1ng mRNA
• 單管反應,整個實驗流程只需一天

常見問題解答
1. 在RNA轉錄組建庫流程中用到Gnome Size Selector的原理及用途?
在RNA轉錄組建庫流程中3次用到Gnome Size Selector。第一次是在RNA5’接頭連接之后,是RNA水平的size selection。目的是去除未連接的5’接頭,并進行緩沖液的置換。第二次是在第一鏈cDNA合成之后,是單鏈cDNA的size selection。目的是去除多余的RT primer,并進行緩沖液的置換。第三次是對PCR產物進行分子量區間的篩選,是更常規意義上的size selection。

2. RNA斷裂的大致片段區間是多少?
在我們提供的斷裂體系中,95度5min斷裂的片段大小大概在100-700nt。其中主要片段分布在300-500nt。對分子量區間有其它要求的用戶請聯系技術支持。

3. RNA Seq 構建的文庫接頭和Illumina的接頭是否有區別?
用我們的方法構建的RNA Seq的文庫和IlluminaTruSeq 完全兼容。當然由于流程的區別,選用的各種adaptor和逆轉錄引物是不同的,所以不可以用Illumina的RT或PCR引物替換我們提供的引物。

4. RNA轉錄組樣品制備是否有方向性?接頭是怎么加的?
RNA轉錄組文庫構建是有方向性的。在被斷裂的RNA5’端加上接頭,在合成第一鏈cDNA的時候通過逆轉錄引物引入另一個接頭。這樣生成的第一鏈cDNA的兩端各有一個接頭,mRNA序列對應的5’和3’接頭序列是不一樣的。所以測序得到的結果可以知道序列的走向。

5. RNA轉錄組樣品制備,整個流程需要多長時間?原因是為什么?
RNA轉錄組樣品制備步驟簡單,耗時少,只需要6個小時即可完成。主要步驟為RNA斷裂,5’接頭的連接,第一條cDNA的逆轉錄和PCR擴增及純化。因為減少了第二條cDNA鏈的生成和下游DNA文庫的構建,所以流程大大縮短。

6. 高通量測序RNA 轉錄組樣品制備,mRNA一般的用量是多少?最低起始量是多少?
mRNA一般的用量是100ng,PCR進行10-13個循環。mRNA起始量可以降到10ng,PCR進行15個循環左右,得到的數據信息覆蓋率和100ng差別不大。如圖1所示,10ng與100ng的樣品起始量建庫所得數據,經數據分析,兩者的基因組匹配率與外顯子匹配率差別不大。


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